CAR-T细胞

CAR-T细胞

CAR-T细胞疗法在原理上与其他形式的ACT尤其是TCR-T细胞疗法相似；然而，它不是引入对肿瘤抗原特异的TCR基因，而是设计一种嵌合抗原受体（CAR）并转染到收获的淋巴细胞中。第一代CAR的基本设计涉及对肿瘤细胞表面抗原具有特异性的单克隆抗体的胞外单链可变片段（scFv）（由肽连接的可变重链和可变轻链组成）；这使得可以不受MHC限制地识别细胞表面的肿瘤标志物，从而扩大了反应的特异性和可定制性。scFv区与铰链区相连，铰链区又与跨膜结构域和由CD3蛋白的CD3ζ亚基组成的胞内尾相连，胞内尾促进细胞内信号传导和T细胞活化。

通过添加共刺激结构域对CAR设计进行改进，对于抵消第一代CAR-T细胞中观察到的快速无反应性非常重要，因为这种无反应性会导致细胞持久性不足。加入单个（第二代）或一对（第三代）共刺激结构域，其中最常见的是CD28、4-1BB或ICOS（可诱导T细胞共刺激物/CD278），可增强受体促进细胞因子分泌、T细胞扩增和增殖的能力，从而促进持久性。下图 2直观地说明了这些内容。

图 2

CAR 的结构。所有嵌合抗原受体 (CAR) 都具有相同的细胞外结构，由针对目标肿瘤抗原的抗体的单链可变片段 (ScFV) 部分组成。第一代 CAR 仅包含一个细胞内信号传导组件：CD3ζ。在 CD3ζ 中添加共刺激结构域（例如 CD28 或 4-1BB）可产生第二代 CAR。第三代 CAR 除了 CD3ζ 外还包含两个共刺激结构域。第四代 CAR 可以在 CAR 抗原识别后激活下游转录因子（例如 NFAT），从而产生细胞因子。

文献中描述了 CAR 设计的进一步增强和发展。第四代 CAR 共表达细胞因子基因，如 IL-12、IL-15 和 IL-17，这些基因有助于携带此类受体的细胞的克隆扩增。研究表明，这些因子的分泌可以调节免疫抑制肿瘤微环境，增强宿主对抗原阴性肿瘤细胞的反应。

临床影响

CAR-T 细胞被设计用于临床治疗；因此，应主要根据其在临床领域的表现来评判。在这方面，CAR-T 细胞疗法的结果可以归纳为两大类：CAR-T 细胞在血液系统恶性肿瘤中的临床试验显示出前所未有的反应率，尤其是在 B 细胞恶性肿瘤中，而 CAR-T细胞在实体瘤中的应用则不太成功。

使用 CD19 特异性 CAR-T 细胞靶向 CD19 抗原被描述为 B 细胞急性淋巴细胞白血病 (B-ALL) 的“游戏规则改变者”，一些临床试验中观察到的完全缓解率为 70-94%。这些结果促使 FDA 批准 tisagenlecleucel (Kymriah) 用于治疗 25 岁以下患者的复发或难治性 B-ALL。然而，在 30-50% 的病例中，反应并不持久，复发最常发生在治疗一年内。

CAR-T 细胞疗法也已用于治疗难治性大 B 细胞淋巴瘤，并取得了显著成功。Axicabtagene ciloleucel (Yescarta) 治疗此类癌症的客观缓解率为 82%，完全缓解率为 54%；在部分患者中，这种缓解得以维持，其中 40% 的患者在 15.4 个月的随访后继续保持完全缓解。FDA 于 2017 年 10 月批准该疗法用于治疗此类疾病。

使用CAR-T细胞治疗 B 细胞恶性肿瘤会导致 B 细胞库几乎被清除；这是因为 CD19在正常 B 细胞上表达，代表了靶向/肿瘤外效应的一个例子。在临床实践中，这种毒性是通过静脉注射免疫球蛋白来控制的；然而，由于缺乏管理其他造血谱系耗竭的策略，可能会限制CAR-T细胞用于分离细胞谱系。

实体瘤

难以选择合适的靶抗原是阻碍CAR-T细胞在实体瘤中取得进展的关键因素之一。很难鉴定肿瘤特异性的实体瘤表面抗原，因为大多数实体瘤抗原只是过度表达，导致存在靶向/脱瘤效应的风险。选择靶抗原的另一个混杂因素是实体瘤具有高度异质性的概念，这意味着抗原在肿瘤细胞中的表达水平存在不规则性。这允许肿瘤通过导致抗原阴性肿瘤逃逸的免疫编辑过程去除最具免疫原性的抗原。

鉴于不规则的抗原表达阻碍了 CAR-T 细胞的进展，了解抗原表达的基本水平似乎有助于诱导肿瘤消退。然而，正如 Newick 等人在评论中所探讨的那样，在这个问题上缺乏共识；这是由于表位扩散现象，即 CAR-T 细胞杀死恶性细胞会释放新的免疫原性抗原，刺激宿主对肿瘤产生内源性适应性免疫反应，从而导致杀死肿瘤细胞的“连锁反应”很难提前预测。

有人提出，为了克服肿瘤特异性抗原的低表达和可变表达，可以使用在其表面表达两种 CAR 的双 CAR-T 细胞同时靶向多种抗原，两种 CAR-T 细胞系都具有不同的抗原特异性，或使用更新颖的 CAR 设计，例如串联 CAR-T 细胞、组合 CAR 或 synNotch 受体。。串联 CAR 在单个 CAR 分子中包含两个不同的 scFv，并且可以串联排列为堆栈或中断的环状结构，如图 3所示. 组合 CAR 与双 CAR 相似，不同之处在于一个 CAR 表达 CD3ζ 信号域，而其伙伴包含共刺激信号域。合成 Notch (synNotch) 受体在其相应抗原的抗原识别后产生第二个 CAR 的转录。

毒性

与 TCR-T 细胞一样，CAR-T 细胞可以对自身抗原产生反应，从而诱导靶向/脱瘤毒性。摩根等人。描述了一个案例，其中具有与单克隆抗体曲妥珠单抗（抗 ERBB2）同源的 scFv 区域的 CAR-T 细胞用于患有转移性结肠癌的患者，该患者因肺上皮细胞上 ERBB2 表达水平低导致弥漫性肺泡损伤而死亡(DAD) 导致急性呼吸窘迫综合征 (ARDS) 的临床表现。这再次凸显了在 CAR-T 细胞和 TCR-T 细胞疗法中始终存在的挑战，即知道要靶向哪些抗原以及由于拟态导致自身反应性而应避免哪些抗原。

CAR-T 细胞的其他主要不良反应包括细胞因子释放综合征 (CRS) 和神经毒性（有时称为 ICANS，免疫效应细胞相关神经毒性综合征）。CRS 的发生是由于 CAR-T 细胞产生和分泌大量细胞因子和炎症分子，可导致多器官衰竭。Wang 等人估计了 CRS 的发生率。范围从 30% 到 94% 的患者。CRS 严重程度的因素包括施用的 T 细胞剂量、细胞活化程度和 T 细胞扩增程度。严重 CRS 的危险因素包括肿瘤负荷大的患者、存在合并症的患者以及在开始治疗后 3 天内出现症状的患者。

据报道，接受 CAR-T 细胞疗法的患者中有 20-64% 会出现神经毒性，最常见的表现为脑病、头痛或精神错乱。据报道，在最严重的病例中，脑水肿在 ALL 患者抗 CD19 CAR-T 的 Juno Therapeutics 临床试验中被证明是致命的 (NCT02535364)。目前正在阐明 ACT 中神经毒性的病理生理学；然而，据推测，血脑屏障中过量的全身性细胞因子和内皮功能障碍可能是错误的。有证据表明 CD19 可能在脑组织上表达；然而，蒂托夫等人。注意到支持缺席的证据胜过它的存在. 另一个潜在因素可能是 CAR-T 细胞中包含的共刺激域：与 4-1BB CAR-T 细胞相比，含有 CD28 的细胞与更高的神经毒性发生率相关。

CRS 和神经毒性事件的管理在很大程度上取决于及时识别、严重程度分级和对发生此类不良事件的患者的监测。必要时应开具积极的支持疗法，如液体复苏、血管升压药、抗癫痫药、抗心律失常药和插管。Tocilizumab 是一种抗 IL-6 受体单克隆抗体，经 FDA 批准用于 CAR-T 细胞 CRS ；它通常与皮质类固醇一起使用。

CAR-T细胞设计的细微差别

用基因编码的自杀开关编码 CAR-T 细胞（或实际上是 TCR-T 细胞）已被用作控制潜在危险和自身反应性 T 细胞的机制，这些 T 细胞可以在发生不良事件时被激活。最常用的开关是基于单纯疱疹病毒胸苷激酶的开关，它允许通过更昔洛韦给药或使用诱导型 caspase-9 (iCasp9) 消融 T 细胞，后者在给药后使用少量；否则，生物惰性分子 AP1903 会引起 iCasp9 的二聚化和激活，从而导致选择性 CAR-T 细胞死亡。

这种小分子操纵 CAR-T 细胞反应的概念在“On-switch CAR-T 细胞”中也很明显；这些受体在存在特定激活分子之前是无功能的，这有助于形成活性受体。

如上所述，分裂信号 CAR，例如双重、组合、串联或 synNotch CAR，可用于增加 CAR-T 细胞对抗原表达可变的肿瘤的敏感性。可以采用类似的机制来降低脱靶毒性的风险。抑制性 CAR (iCAR) 可以与传统的活化 CAR 在 T 细胞上共表达；iCAR 对正常组织上表达的抗原具有特异性，并通常通过 PD-1 或 CTLA-4 信号通路产生显性负信号，从而抑制细胞的反应，抵消从激活受体接收到的信号。通过这种方式，也可以通过 iCAR 选择性地保护也表达肿瘤抗原的正常组织。

2016 年，合成 Notch (synNotch) 受体的开发为设计具有可编程功能的 CAR-T 细胞提供了巨大的灵活性；该受体由一个标准的抗原结合 scFv 区域组成，该区域与用户选择的转录因子偶联。这项新技术的一个应用是用双受体回路设计 T 细胞，其中一种抗原的 synNotch 受体诱导第二种抗原的 CAR 表达，从而增加反应的特异性. 鉴于 synNotch 平台的模块化，这项技术的细微差别几乎是无限的；其中的建议包括使用可编程 T 细胞控制细胞因子分泌、输送抗体等治疗剂，甚至指导细胞形成复杂的多细胞结构。

通过使用包括 CRISPR/Cas9 在内的多种工具破坏 TRAC 或 TRBC 基因（分别编码 TCR α 和 β 链的成分）来耗尽内源性 TCR 复合物，T 细胞的基因编辑已被用于降低 GVHD 的风险, TALENs 或 Zinc-Finger 。其他可能有利于编辑的基因包括编码 PD-1 的 PDCD1，PD-1 是一种关键的免疫检查点调节因子，通常通过上调其配体 PD-L1 成为恶性细胞的目标。在临床前模型中，CRISPR/Cas9 生成的 PD-1 缺陷型 CAR-T 细胞对 PD-1 介导的免疫抑制具有抗性. 最近一项探索这两种假设的临床试验 (NCT03399448) 调查了 NY-ESO-1 靶向自体 TCR-T 细胞与 CRISPR 编辑的内源性 TCR 和 PD-1 在多发性骨髓瘤和肉瘤中的安全性、可行性和有效性. 这些改变的细胞在循环中的持久性增强，观察到的水平稳定 9 个月；这与之前报道的约 1 周的 NY-ESO-1 靶向 T 细胞半衰期相比有优势。虽然与疗效有关的结果可能有点令人失望（在三名患者中的两名患者的活检中发现残留肿瘤，肿瘤抗原减少表明抗原阴性逃逸），但没有临床毒性是非常令人鼓舞的。鉴于这是多重 CRISPR/Cas9 编辑的 T 细胞的首次人体试验，未来的工作无疑将建立在这一早期成功的基础上。

鉴于自体 CAR-T 细胞制造的耗时性，内源性 TCR 复合物的破坏开启了同种异体或“现成”形式的 CAR-T 细胞疗法的可能性，这在以下方面具有巨大优势生产成本、生产速度和快速进展性疾病患者的可用性。

SUPRA CAR 也是迈向“通用”CAR-T 疗法的重要进展（图 4）。分裂、通用和可编程 (SUPRA) CAR 有两个元素：一个 zipCAR，它由一个连接到细胞内 T 细胞信号域的细胞外亮氨酸拉链组成，另一个是单独的 zipFv，它包括一个与抗原配对的匹配亮氨酸拉链-特异性scFv。两个亮氨酸拉链的配对将细胞外信号传输到细胞内区域，导致 T 细胞激活. 这种设计允许根据需要更改 zipFv 中的 scFv，而无需重新设计细胞，因为新的 zipFv 也将具有与原始批次的 zipCAR T 细胞结合的能力。这一特征有可能在抗原靶向方面引入革命性的灵活性，这可能会提高治疗效果，并减少抗原逃逸和疾病复发，这是由同时和顺序靶向多种抗原的能力所支持的。